微生物过程研究室

微生物过程研究室简介

微生物过程研究室以国家生物发酵工业重大需求为出发点,致力于工业生物技术和产品的研发。以离子束和等离子体细胞修饰为特色平台,结合现代分子生物学、代谢工程、生化工程等学科知识,研究工业微生物菌种离子束和等离子体诱变选育、代谢网络分析和控制、发酵分离偶联、形态信息分析控制、微生物转化和非水相生物催化、工业发酵过程优化与设计放大、微生物活性物质的分离纯化等技术过程。
    多年来,本室研究涵盖了酶类、维生素、有机酸、抗生素和氨基酸等多种类型发酵品种,其中维生素C和花生四烯酸研究成果成功实现产业化,纤维素酶、木聚糖酶、生物表面活性剂、辅酶Q10、L-乳酸、抗菌多肽和生物胶等相关研究结果在国内外核心期刊发表,达到较高技术水平,进入产业化研发阶段,表现出良好的工业应用前景。

一、重要研究方向
1、工业微生物诱变育种
运用离子束注入修饰技术、低温等离子体等物理化学诱变手段,在诱变选育具有工业应用前景的高产高效微生物菌种的同时,探讨离子束及等离子体诱变机理。

2、发酵与代谢控制
利用代谢工程相关原理与方法,应用分子生物学和反应工程技术对代谢途径进行分析与修饰,改进细胞性质,并优化培养条件,增加工业生物产品的收率及生产能力。通过代谢通量分析(MFA)、代谢控制分析(MCA)等分析手段增强对发酵过程中代谢和细胞功能的透彻理解,包括其途径合成和热力学可行性问题、途径的通量分布及其控制。通过丝状菌形态学与代谢结合,将丝状菌形态信息与过程控制结合,以产物得率提高为目的,通过计算机模拟和软件分析,建立相关变量过程控制系统,揭示形态学、产率以及环境变量之间的相互关系,优化发酵过程。 


                                           L-乳酸的生物炼制 


木质纤维素水解中主要限制性因素示意图


3、微生物(酶)催化
    将微生物(酶)催化与相关制备技术手段相结合,通过微生物细胞或微生物代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物特定部位(基团)进行催化反应,将复杂的底物进行结构修饰,制备高附加值产品,揭示微生物细胞(酶)与底物和产物间的相互作用规律。

 

 

4、生物活性产物分离纯化
    研究先进的下游加工过程技术以及在发酵液的预处理、提取、精制、成品加工过程中的关键技术问题,对微生物发酵活性产物进行快速、高选择性的分离与纯化,提高产物回收率,降低分离纯化成本。 
 


二、重要研究进展
1、工业微生物诱变育种成果
    生产菌种、发酵过程和下游提取技术是决定微生物工程的工业生产水平的三个要素,其中优良的菌种是首要因素。诱变选育和基因工程技术等选育高产菌株的有效技术手段。利用离子束注入修饰平台,实验室前期在Vc和花生四烯酸生产菌株的诱变选育中取得显著的成果。近年来,通过离子注入选育出枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis抗菌脂肽生产菌株(活性提高,发酵时间缩短,Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005)和生物表面活性剂surfactin高产菌株(产量提高3倍,Plasma Sci. Technol. 2006),米根霉Rhizopus Oryzae高产L-乳酸菌株(耐高温菌株,J. Microbiol. Biotechnol. 2004;耐酸菌株,Plasma Sci. Technol. 2007;利用木糖菌株,Plasma Sci. Technol. 2007),壳聚糖酶产生菌(芽孢杆菌S65,酶活提高6倍,J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006;结合菌属Gongronella JG,酶活提高1倍,L. Appl. Microb. 2008.),根癌农杆菌A.Tumefacien辅酶Q10合成菌株(产量提高1倍,Plasma Sci. Technol. 2008),黑曲霉Aspergillus niger产β-葡萄糖苷酶高产菌株(酶活提高106.8%,辐射研究与辐射工艺学报,2010),有效利用木糖的产油高山被孢霉Mortierella alpina I502-8(生物量和菌体油脂积累量分别提高了2.59倍和2.05倍,原料糖利用率达到99.4%,Chem. Eng. Tech. 2011),成效明显。并逐步开展低温空气等离子体新型诱变选育技术研究,为对常用诱变剂产生诱变饱和的工业生产菌株提供了新的诱变方法,在青霉素产生菌产黄青霉Penicillium chrysogenum高产菌株选育中取得较好的应用效果(产量提高80%,Plasma Sci. Technol. accepted),并初步研究了其诱变机理。

2、辅酶Q10 生物合成途径中代谢通量分析
    代谢通量分析是代谢途径通量确定,实现代谢分析及进行代谢控制最有效和最重要的方法之一,是一种专门对代谢途径流量进行测定分析的方法。它将细胞的代谢系统视为一个网络,并通过代谢分析确定目的产物的载流途径、与载流途径有关的亚网络及其中的主要节点。然后,利用细胞内主要反应的化学计量模型及应用围绕代谢物的质量平衡关系计算出不同操作环境下或不同突变株代谢流分布情况,再经比较研究对主要节点的刚性进行评估,在此基础上再进行基于代谢调控理论进行育种方案与策略的设计,最终通过遗传操作等手段实现定向修饰和改造的目的。根据微生物学和生物化学相关知识及前人对辅酶Q10 生物合成途径研究结果,初步合成了Agrobacterium tumefaciens ATCC4452目标产物形成的主要代谢途径。并以此为基础构建出ATCC4452胞内主要代谢网络图,结合计量学模型和质量平衡原理,并以准稳态假设为基础分析了ATCC4452在三种不同操作下的通量分配及变化情况。对所识别出的辅酶Q10 生物合成途径中的关键环节,实施了针对关键点、关键流和关键库定向“增流扩库”和“混合筛选”的育种策略,快速筛选到两株产量较高的变异株(Appl. Microbiol. Biotechnol., 2006; Process Biochemistry, 2006;Plasma Science and Technology, 2008)。 


图1. ATCC4452在不同培养条件下流量分布情况
Fig 1. Metabolic flux distribution of ATCC4452 under different culture conditions

 

3、枯草芽孢杆菌JA挥发性抑菌物质的研究 

  枯草芽孢杆菌B. subtilis产生的抗生素在防治真菌病害方面扮演着重要作用,但对于其产生的挥发性物质在生物防治中的作用却知之甚少。我们的研究表明,B. subtilis JA产生的挥发性物质能够在体外显著抑制病原真菌灰葡萄孢霉B. cinerea孢子的萌发和菌丝的延伸,并在4 h内快速发挥作用。处理30 h后,部分菌丝管中的原生质回缩,菌丝体产生中空现象,导致生长停滞和死亡。挥发性物质抑制B. cinerea菌丝生长的机制还很不清楚。有些真菌,包括菌根真菌(AMF),原生质从菌丝顶端到孢子的回缩现象是其在逆境条件下为了长期保持发育能力和侵染力的一种长期策略。然而,当B. cinerea菌丝中原生质发生回缩后,将其转移至无挥发性物质存在的新鲜PDA培养基中,菌丝也不再生长。这一结果说明,B. cinerea中原生质的回缩是一种致死现象而非存活策略。JA产生的挥发性物质的抗真菌作用也被发现于JA与菌根真菌Glomus etunicatum的相互作用过程中,表明其抗真菌作用具有广谱性。收集鉴定了14种JA挥发性物质,其中已知2-乙基-1-己醇、2-壬酮、2,4-bis (2-甲基丙基)-苯酚和4-羟基苯甲醛4种化合物具有抗真菌作用。而利用有益微生物产生的挥发性物质防治水果腐烂病害还未见报道,显示JA挥发性抑菌物质的潜在利用价值(Biotechnol Lett, 2008)。 

 


4、生物表面活性剂高泡发酵 

  在生物发酵制品的生产过程中,严重的泡沫是阻碍发酵正常进行的一个重要因素。这种现象在诸如surfactin这样的高效生物表面活性剂的生产中尤为突出,发酵液中活性产物浓度越大,问题越严重。由发酵搅拌和通气造成的发酵液泡沫,由于表面活性剂的存在而变得稳定。过量泡沫的溢出带走发酵液、菌体细胞和发酵产物,并容易造成发酵污染。抑制泡沫的方法一般是在发酵液中添加化学消泡剂,但是添加的化学消泡剂会减少氧气的传输效率,对细胞的生长产生不利的影响,并且增加生产费用。我们通过分析生物表面活性剂发酵的特点,泡沫产生的规律以及传统生物反应器的缺陷,着重进行生物反应器的消泡装置和动力系统的设计,在现有发酵罐上增加两级泡沫消泡回流以及产物在线分离系统来解决发酵泡沫问题和产物抑制问题,使产物得率大幅提高,发酵周期缩短;全回流系统采用无菌压缩空气做为循环动力,利于工业化规模实现,并对高泡发酵过程具有通用性(Food Technol. Biotechnol. 2009)。 


5、壳聚糖酶与葡聚糖酶的相关研究 

  (1)甲壳素是乙酰氨基葡萄糖的多聚体,是自然界中年生物合成量仅次于纤维素的第二大可再生资源;甲壳素脱乙酰基之后成为壳聚糖;壳聚糖降解后的产物壳寡糖具有较高的溶解度,在生物医学等领域具有重要应用。酶降解法制备的水溶性低聚壳聚糖生物活性高,生产工艺对环境无污染,是发展趋势,但是由于酶活及酶产量低,成为制约发展的瓶颈。我们从自然界分离到产壳聚糖酶的一株芽孢杆菌属Bacillus sp.S65,利用实验室蛋白分离纯化平台对Bacillus sp. S65发酵液中的壳聚糖酶进行了分离纯化研究,经过超滤浓缩、阴离子交换和凝胶过滤,得到SDS-PAGE单一的壳聚糖酶,并对壳聚糖酶的酶学性质进行了初步研究(J. Agric. Food Chem. 2006)。另分离到产壳聚糖酶的一株结合菌属Gongronella JG,是目前所见报道的唯一产壳聚糖酶的接合菌(L. Appl. Microb. 2008)。 


  (2)内切β-1,4-葡聚糖酶是组成纤维素酶系的一种重要纤维素酶,随机内切纤维素分子内的β-1,4-葡萄糖苷键。微生物来源的葡聚糖酶通常包括催化结构域和纤维素结合结构域,两个结构域中间由连接肽连接。虽然纤维素结合结构域和催化结构域具有各自的功能,但是纤维素结合结构域和连接肽对于催化结构域功能的发挥和其构象稳定性的维持具有一定的影响。我们针对枯草芽孢杆菌JA18纤维素酶性质及其改造进行了研究,围绕该葡聚糖酶的稳定性等催化特性,通过基因工程技术的方法构建该葡聚糖酶的各种突变酶,并通过生物化学方法研究了该酶纤维素结合结构域对催化结构域性质的影响,结果发现:C末端纤维素结合结构域缺失突变体之一(Egl22-330)与Egl22-499相比,热稳定性有很大提高,位于该葡聚糖酶的纤维素结合结构域和连接肽对维持催化结构域稳定性具有重要作用(Bioresource Technology 2009)。 


6、L-乳酸的相关研究 

  L-乳酸是一种非常重要的有机酸,广泛应用于食品、医药和化工等领域。实验室首先从菌种入手,通过对米根霉菌种的多年选育,获得多株具有产业化前景L-乳酸高产菌株。包括葡萄糖、玉米液化液、木糖以及混合糖高效利用菌株,其中以玉米液化液为底物时L-乳酸产量可以达到130g/L以上;木糖葡萄糖混合糖高效利用菌株,对混合糖的利用率可以达到80%以上,Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology杂志编辑认为这是种生产L-乳酸具有重要意义的新方向。
在发酵工艺方面,研究了多种不同细胞固定化方法,实现固定化细胞保持高产15批次以上,可大大节约发酵时间与成本。通过固定化细胞与双极膜电渗析发酵分离偶联生产L-乳酸,可以实现乳酸发酵与分离的同步进行,工艺绿色环保。整个过程的转化率为81.22%,损失率为1.5%,能耗为0.81kwh/kg,电流效率为91.8%,得到的L-乳酸浓度可达144.31g/L。电渗析残液补糖后可回到发酵罐中用于固定化米根霉发酵生产L-乳酸,生成NaOH用于循环产酸中和发酵。该工艺实现了L-乳酸的无钙化生产,大大降低了三废排放,有很好的应用前景。(Plasma Science&Technology 2008,J. Ind. Microb. Biotech., 2009) 

图 发酵分离偶联生产L-乳酸双极膜装置中三室浓度变化


7、微生物柴油联产精细化学品的相关研究 

  以秸秆为原料发酵的微生物油脂用于生物柴油的生产,是解决目前存在的生物柴油原料来源限制问题的潜在途径。我们通过多轮氮离子束诱变,筛选出一株有效利用木糖的产油高山被孢霉I502-8(Mortierella alpina I502-8,MAI502-8),突变株具备以葡萄糖/木糖(W/W:5/3)组成的混合糖为碳源的生长和油脂积累特性;通过产油微生物高密度和代谢调控,生物量和菌体油脂含量分别达29.8 g/L和11.7 g/L,分别是出发菌的2.59倍和2.05倍,同时原料糖利用率达99.4%;研究了微生物油脂炼制和分提技术,湿法分提可以得到70%生物柴油和30%的高端油脂;高端油脂回收率80-90%。制备的生物柴油品质基本符合国家生物柴油质量标准BD100和美国ASTM D6751-2003标准。研究结果为秸杆废弃物到生物能源的转化提供一条全新的技术路线,对秸杆废弃物的综合利用和生物柴油的技术开发都具有重要理论和实际指导意义(Preparative Biochmistry & Biotechnology, 2007;Chemical Engineering & Technology, 2011)。 

微生物油脂发酵调控曲线
Time course of MAI502-8 lipids fermentation control


MAI502-8的发酵菌丝形态
The hyphal morphology of MAI502-8 fermentation



三、十一五期间科研项目
1. 抗生素发酵形态信息与控制系统,国家高技术研究发展计划(863计划)目标导向性课题。
2.离子束诱变Bacillus subtilis natto维生素K2代谢网络通量的研究,中国科学院知识创新工程青年人才领域前项目(Y09FCQ5121)。
3. 单宁酶开发和酯转换合成没食子酸丙酯研究,中国科学院知识创新(KSCX2-YW-G-050)。
4. 井冈霉素菌种发酵优化分离纯化,企业横向。
5. 丝状微生物工业发酵形态结构动力学研究,重点实验室开放基金(2008B002)。
6. 微生物柴油高产菌株离子束修饰及代谢调控,合肥研究院院长基金课题(HY-DLZ/JC-2008YZJJ-3)。
7. 汽爆秸秆两步发酵高纯度L-乳酸,安徽省重点攻关科技项目(07010202076)。
8. 新型生物表面活性剂中试及产业化,企业横向。
9. 离子束诱变L-乳酸高产菌株选育及发酵,国家高技术研究发展计划(863计划)重点项目(2006AA020102)子课题。
10.离子束诱变A.tumefaciens 辅酶Q10代谢网络通量的研究,国家自然科学基金项目(20576132)。

四、代表性研究论文及专利
1. Wang Peng, Zhang Lamei, Zheng Zhiming, Wang Li, Wang Hui, Yuan Chengling, Gong Guohong. Microbial lipid production by co-fermentation with Mortierella alpine obtained by ion beam implantation, Chemical Engineering & Technology, 2011, 34 (3): 422-428.
2. Gui Fang, Wang Hui, Wang Peng, Liu Hui, Cai Xiaochun, Hu Yihua, Yuan Chengling, Zheng Zhiming. Air plasma mutation breeding for Penicillium chrysogenum, Plasma science and Technology, (accepted)
3. Wang Peng, Xiaoni Zhang, Li wang, Zhang zhen, Mingli Tang , Jiabin Li. Subinhibitory concentrations of ciprofloxacin induce SOS response and mutations of antibiotic resistance in bacteria, Ann Microbiol, 2010, 60:511–517
4. Wang Peng, Li Juan, Wang Li, Tang Mingli, Yu Zengliang, Zheng Zhiming. L(+)-Lactic acid production by co-fermentation of glucose and xylose with Rhizopus oryzae obtained by low-energy ion beam irradiation, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2009, 36(11): 1363-1368.
5. Yujuan Wang, Hang Yuan, Jun Wang, Zengliang Yu, Truncation of the Cellulose Binding Domain Improved Thermal Stability of Endo-β-1, 4-glucanase From Bacillus subtilis JA18 ;Bioresource Technology, 2009, 100: 345-349.
6. G.H. Gong, Z.M. Zheng, H. Chen, C.L. Yuan, P. Wang, L.M. Yao, Z.L. Yu. Enhanced production of surfactin by Bacillus subtilis E8 mutant obtained by ion beam implantation. Food Technol. Biotechnol. 2009, 47(1): 27-31.
7. Hua Chen,Xiang Xiao,Jun Wang,Lijun Wu ,Zhiming Zheng ,Zengliang Yu, Antagonistic effects of volatiles generated by Bacillus subtilis on spore germination and hyphal growth of the plant pathogen, Botrytis cinerea.Biotechnol Lett, 2008, 30: 919-923.
8. XU Dejun, ZHENG Zhiming, WANG Peng,WANG Li, YUAN Hang, YU Zengliang, Breeding of Coenzyme Q10 Produced Strain by Low-Energy Ion Implantation and Optimization of Coenzyme Q10 Fermentation.Plasma Science and Technology, 2008,10(6): 758-763.
9. H. Chen, L. Wang, C.X. Su, G.H. Gong, P. Wang and Z.L.Yu, Isolation and characterization of lipopeptide antibiotics produced by Bacillus subtilis.Letters in Applied Microbiology, 2008, 47: 180-186.
10. Fan Yonghong,Yang Yingge, Zheng Zhiming .Enhancement of L(+)-Lactic Acid Production of Immobilized Rhizopus oryzae Implanted by Ion Beam. Plasma Science&Technology, 2008, 10: 115-119.
11. W. Zhou, H. Yuan, J. Wang and J. Yao Production, purification and characterization of chitosanase produced by Gongronella sp. JG Letters in Applied Microbiology. 2008. 46(1): 49-54.
12. LI Wen, Zheng Zhiming, Yu Zengliang. Optimization of L(+)-lactic Acid Fermentation without Neutralisation of Rhizopus Oryzae Mutant RK02 by Low-Energy Ion Implantation. Plasma Science & Technology, 2008, 10(2): 260-264.
13. YANG Yingge, FAN Yonghong, LI Wen, WANG Dongmei,WU Yuejin, ZHENG Zhiming,YU Zengliang, Optimization of L(+)-Lactic Acid Production from Xylose with Rhizopus Oryzae Mutant RLC41-6 Breeding by Low-Energy Ion Implantation. Plasma Science and Technology, 2007, 9(5): 638-642.
14. Chengling Yuan,Xiangqin Wang,and Zengliang Yu, Separation and Preparative Purification of Arachidonic Acid from Microbial Lipids by Urea Inclusion Reaction and HPLC. Preparative Biochmistry & Biotechnology, 2007,37: 149-159.
15. Shao-Bin Gu, Jian-Ming Yao, Qi-Peng Yuan, Pei-Jian Xue, Zhi-Ming Zheng, Li Wang, Zeng-Liang Yu, A novel approach for improving the productivity of ubiquinone-10 producing strain by low-energy ion beam irradiation. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 72: 456-461。
16. Shao-Bin Gu, Jian-Ming Yao, Qi-Peng Yuan, Pei-Jian Xue, Zhi-Ming Zheng, Zeng-Liang Yu, Kinetics of Agrobacteriumtumefaciens ubiquinone10batch production. Process Biochemistry, 2006, 41:1908-1912.
17. Caixin Su, Wei Zhou, Yonghong Fan, Li Wang,Shiguang Zhao, Zengliang Yu, Mutation breeding of chitosanase-producing strain Bacillus sp. S65 by low-energy ion implantation. J. Ind Microbiol Biotechnol, 2006, 33:1037-1042.
18. Caixin Su, Dongmei Wang, Liming Yao And Zengliang Yu, Purification, Characterization, and Gene Cloning of a Chitosanase from Bacillus Species Strain S65. J. Agric.Food Chem, 2006, 54: 4208-4214.
19. Liu Qingmei, Yuan Hang, Wang Jun, Gong Guohong, Zhou Wei. A Mutant of Bacillus subtilis with High-producing Surfactin by Ion Beam Implantation. Plasma Science & Technology. 2006, 8: 491–496.
20. Liu J., Liu M., Wang J., Yao J.M., Pan R.R., Yu Z.L. Enhancement of the Gibberella zeae growth inhibitory lipopeptides from a Bacillus subtilis mutant by ion beam implantation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69(2): 223-238.
21. Liu Qingmei, Yao Jianming, Pan Renrui, Yu Zengliang. A mutant strain of a surfactant-producing bacterium with increased emulsification activity. Plasma Science & Technology. 2005, 7(3): 2885-2892.
24. Liu J., Yao J.M. Study on mutagenic breeding of Bacillus subtilis and properties of its antifungal substances. Plasma Science & Technology. 2004, 6(4): 2433-2436.
25. Yuan Hang, Zhou Wei, Wang Jun, Liu Qingmei, Zhang Shuqing etc. Enhancement of Gongronella sp. JG Chitosanase production by Ion Beam Implantation. Plasma Science & Technology. 2007, 9(1): 115-118.
26. Chunmei Ge, Shaobin Gu, Xiuhong ZHOU et al. Breeding of L(+)-Lactic Acid Producing Strain by Low-Energy Ion Implantation. J. Microbiol. Biotechnol. 2004, 14(2): 363-366.
27. 王辉,桂芳,王鹏,刘会,王丽,郑之明. 菌丝空泡形态与青霉素合成的关系研究, 生物加工过程,2011(已录用)。
28. 刁金山,王丽,陈振,刘会,聂光军,郑之明.低能N+注入选育黑曲霉β-葡萄糖苷酶高产菌株及其发酵优化研究. 辐射研究与辐射工艺学报,2010,28(6):345-351.


申请软件著作权1项与专利10项,获得授权5项:
1. 软件全称:菌丝体显微图像分割及特征提取软件(2011R11S044664)。
2. 专利名称:一种泡沫回流发酵系统(200920187963.1)。
3. 专利名称:有效缩短阿维链霉菌发酵周期提高阿维菌素产量的方法(200610086279.5)。
4. 专利名称:一种磁聚物絮凝集预处理L-乳酸发酵液的方法(200610041238.4)。
5. 专利名称:枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离提纯方法(200410014483.7)。

研究条件与团队:
  微生物过程研究室是中科院合肥物质科学研究院技术生物与农业工程研究所中进行工业生物技术课题研究的科研单元,专业从事大宗化学品、精细化学品、工业酶等发酵技术研究,拥有完备的实验室、科研仪器等科研条件。现有研究员1名、副研究员2名、助研3名和一批年轻有为的硕士、博士研究生队伍。 



联系方式:
安徽省合肥市1138信箱中科院技术生物所微生物过程研究室
邮编:230031
电话:0551-5593145,5593148
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